EPI300电击感受态细胞 ,克隆电击感受态细胞

 
EPI300Electroporation-CompetentCell50μl/支 
pUC19(controlvector，10pg/μl):10μl 
保存条件(保质期)：-80℃（6个月） 
基因型 
F–mcrA∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ∆M15∆lacX74recA1endA1araD139∆(ara,leu)7697galUgalKλ–rpsLnupGtrfAdhfr. 
产品说明 
EPI300电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。EPI300细胞含有一个突变的trfA基因，该基因表达出的蛋白产物可以促进含有oriV复制子的质粒的高拷贝扩繁，诱导剂Ⅰ可以诱导trfA基因的表达。当含有oriV复制子质粒的EPI300细胞在LB/2YT或SOB培养基中生长时，trfA基因的表达被抑制，oriV复制子质粒的拷贝数维持在很低的水平；当在培养基中加入诱导剂Ⅰ，oriV复制子质粒的拷贝数可维持在很高的水平，提高了质粒产量。因此EPI300菌株可以降低oriV复制子质粒的拷贝数，特别适合于各种不稳定DNA或毒性基因的克隆。[mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI300菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（例如：哺乳动物基因组DNA）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacZΔM15标记的存在使EPI300可用于蓝白斑筛选，rpsL赋予其链霉素抗性。此外，EPI300电击感受态细胞转化效率极高，特别适用于文库构建，EPI300电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>2×1010cfu/μgDNA。 
操作方法 
1.0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。 
2.取-80℃保存的EPI300电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。 
A.测定转化效率使用1μl10pg/μl的对照质粒pUC19； 
B.对于连接产物，大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与EPI300电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100ng/μl，体积不超过5μl/50μl感受态。 
C.对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mMTrisHCl,pH7.5;1mMEDTA)重悬，然后与EPI300电击感受态混合进行电击转化。 
3.用200μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。 
4.启动电转仪，设置参数：C=25μF，PC=200Ω，V=1.8kV(此为BioRad电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。 
5.2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700μl不含抗生素的无菌S.O.C.培养基（室温），用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml离心管（BDFalcon50ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C.培养基至10ml。37℃，225rpm复苏60分钟。 
6.5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。 
S.O.C培养基配方 
2%Tryptone 
0.5%YeastExtract 
10mMNaCl 
2.5mMKCl 
10mMMgCl2 
10mMMgSO4 
20mMglucose 
PH-7.0 
S.O.C.MediumissuitableforuseinthefinalstepofcelltransformationtoobtainmaximaltransformationefficiencyofE.coli(Hanahan,1983). 
注意事项 
1.加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。 
2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。 
3.当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。 
4.电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。 
5.若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。 
6.对于连接产物转化，部分公司的连接体系或重组体系(例如：Thermo，NEB公司的T4连接酶系统，NEB，天根的50度反应重组系统)可以直接与EPI300电击感受态混合后电击转化，无需纯化，但DNA浓度不能过高，最好不超过100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。 
7.混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。 
8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。