DH10B电击感受态细胞 ,克隆电击感受态细胞

  
DH10BElectroporation-CompetentCell50μl/支  
pUC19(controlvector，10pg/μl):10μl  
保存条件(保质期)：-80℃（6个月）  
基因型  
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)ϕ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galE15galKλ-rpsLnupG  
产品说明  
DH10B电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。DH10B菌株来源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(无论真核生物还是原核生物的基因组DNA都能被高效的转入DH10B中)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。φ80dlacZ∆M15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，rpsL赋予其链霉素抗性。DH10B感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建，经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>1010cfu/μgDNA。  
操作方法  
1.0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。  
2.取-80℃保存的DH10B电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。  
A.测定转化效率使用1μl10pg/μl的对照质粒pUC19；  
B.对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mMTrisHCl,pH7.5;1mMEDTA)重悬，DNA浓度不超过100ng/μl，体积不超过5μl/50μl感受态。  
3.用200μl枪头将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。  
4.启动电转仪，设置参数：C=25μF，PC=200Ω，V=1.8kV(此为BioRad电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。  
5.2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700μl不含抗生素的无菌S.O.C.培养基（室温），用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml离心管（BDFalcon50ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C.培养基至5ml。37℃，225rpm复苏60分钟。  
6.5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。  
S.O.C培养基配方  
2%Tryptone  
0.5%YeastExtract  
10mMNaCl  
2.5mMKCl  
10mMMgCl2  
10mMMgSO4  
20mMglucose  
PH-7.0  
S.O.C.MediumissuitableforuseinthefinalstepofcelltransformationtoobtainmaximaltransformationefficiencyofE.coli(Hanahan,1983).  
注意事项  
1.加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。  
2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。  
3.当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。  
4.电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。  
5.若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。  
6.对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液(10mMTrisHCl,pH7.5;1mMEDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。  
7.混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头(普通200ul枪头应剪去枪头尖0.6cm)避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。  
8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。