Stbl4电击感受态细胞 ,克隆电击感受态细胞

  
Stbl4Electroporation-CompetentCell50μl/支  
pUC19(controlvector，10pg/μl):10μl  
保存条件(保质期)：-80℃（6个月）  
基因型  
F′proAB+lacIqZ∆M15Tn10(TetR)mcrA∆(mcrBC-hsdRMS-mrr)recA1endA1gyrA96gal-thi-1supE44λ-relA1∆(lac-proAB)  
产品说明  
Stbl4菌株来源于Stbl2E.colistrain，可用于慢病毒载体或逆转录病毒载体的构建。Stbl4菌株适合克隆不稳定插入片段(正向重复序列，逆转录病毒序列等)；mcrA突变和mcrBC-hsdRMS-mrrdeletion使该菌株更适于克隆甲基化的基因组序列。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacIqZΔM15标记使得Stbl4菌株可用于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素抗性。Stbl4电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达0.5×1010cfu/μgDNA，特别适合于慢病毒质粒文库或逆转录质粒文库的构建。  
操作方法  
1.0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。  
2.取-80℃保存的Stbl4电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。  
A.测定转化效率使用1μl10pg/μl的对照质粒pUC19；  
B.对于连接产物，大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与Stbl4电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100ng/μl，体积不超过5μl/50μl感受态。  
C.对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mMTrisHCl,pH7.5;1mMEDTA)重悬，然后与Stbl4电击感受态混合进行电击转化。  
3.用200μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。  
4.启动电转仪，设置参数：C=25μF，PC=200Ω，V=1.8kV(此为BioRad电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。  
5.2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700μl不含抗生素的无菌S.O.C.培养基（室温），用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml离心管（BDFalcon50ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C.培养基至10ml。30℃，225rpm复苏90分钟。当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化controlpUC19计算转化效率，则需37℃，225rpm复苏60分钟  
6.5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200μl涂布到含相应抗生素的LB平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养17-20小时或30℃培养箱过夜培养20-24小时。若转化controlpUC19计算转化效率，则需37℃培养过夜。  
7.若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基中30度摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：500ml三角瓶中加入100mlTB营养液，经30度250rpm摇菌，可提取约100-200ugPUC19质粒）  
S.O.C培养基配方  
2%Tryptone  
1.2%Tryptone  
2.4%YeastExtract  
4%甘油  
17mMKH2PO4  
72mMK2HPO4  
TB培养基配方  
1.2%Tryptone  
2.4%YeastExtract  
4%甘油  
17mMKH2PO4  
72mMK2HPO4  
配制方法（1L）：1，配制磷酸缓冲液（0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4）：  
溶解2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4于90ml去离子水中，定容到100ml，高压灭菌。2，在烧杯中加入以下试剂：Tryptone12g，YeastExtract24g，甘油4ml；加入去离子水800ml,充分溶解后，定容至900ml，高压灭菌。待溶液冷却至60度以下，加入100ml灭菌磷酸盐缓冲液。  
S.O.C.MediumissuitableforuseinthefinalstepofcelltransformationtoobtainmaximaltransformationefficiencyofE.coli(Hanahan,1983).  
注意事项  
1.Stbl4电击感受只能电击转化，不可用热激方法转化。加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。  
2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。  
3.当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。  
4.电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。  
5.若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。  
6.对于连接产物转化，部分公司的连接体系或重组体系(例如：Thermo，NEB公司的T4连接酶系统，NEB，天根的50度反应重组系统)可以直接与Stbl4电击感受态混合后电击转化，无需纯化，但DNA浓度不能过高，最好不超过100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。  
7.混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。  
8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。