DH10Bac感受态细胞 ,克隆感受态细胞

  
DH10Bac：100μl/支  
pUC19(controlvector，10pg/μl):10μl  
保存条件(保质期)：-80℃（6个月）  
基因型  
F-mcrA∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)ϕ80lacZ∆M15∆lacX74recA1endA1araD139∆(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsLnupG/pMON14272/pMON7124  
产品说明  
DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株中含有父本杆粒bMON14272、辅助质粒pMON7124：父本杆粒bMON14272包含mini-F复制子,卡那抗性基因,attTn7位点和lacZα互补因子；辅助质粒pMON7124含有tnsABCD区（tnsABCDregionsuppliesthetranspositionproteinsrequiredforinsertionofthemini-Tn7fromthedonorplasmidintoitstargetsiteontheparentbacmid），具有四环素抗性，在细胞扩增过程中丢失，但可提高供体质粒pFastBac（具有庆大霉素抗性）转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore,genomicDNA,bothprokaryoticandeukaryotic,canbeclonedefficientlyinDH10Bac）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选，DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μgDNA。  
操作方法  
供体质粒（pFastBac等）转化重组方法：  
1.DH10Bac感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入供体质粒（pFastBac等）1ng，并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。  
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。  
3.向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC液体培养基，37℃，225rpm复苏4小时。  
4.复苏完成后，用SOC稀释转化液到（10-1，10-2），每个稀释用吸取100ul铺一个LB平板（共涂3个平板），平板包含50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，7ug/mltetracycline，40ug/mlX-gal，40ug/mlIPTG。  
5.将平板倒置放于37℃培养箱48h（抗生素含量较高，需在37度长时间培养才能挑到合适克隆）。  
阳性验证：  
1.挑10个白色的克隆，重新划线在LB平板（50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，7ug/mltetracycline，40ug/mlX-gal，40ug/mlIPTG）。37度过夜培养。  
2.挑选白色的克隆，转接到含有50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，7ug/mltetracycline的LB培养液中，过夜培养。  
3.使用试剂盒（QIAGENcat.12162）或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。  
pUC19检测转化效率方法：  
1.DH10Bac感受细胞态从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。  
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。  
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养液LB，37℃，200rpm复苏60分钟。  
4.取100μl转化液涂布到含50-100ug/ml氨苄的LB平板上。  
5.将平板倒置放于37℃培养箱12-16h，统计计算转化效率。  
注意事项  
1.感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。  
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。  
3.涂板时务必涂干，平板表面不留任何水份。